کلید واژه ­ها: سلول ­های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیم­ های متابولیکی، تمایز

	فصل اول: کلیات و هدف
1	1-1  سلول­های بنیادی ………………………………………………………………………
1	1-1- 1 تعریف سلول­های بنیادی…………………………………………..
2	1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی…………………….
3	1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….
4	1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..
4	1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………
6	1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..
7	1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..
10	1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….
10	1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..
11	1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..
12	1-2  تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..
13	1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..
14	1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..
15	1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….
16	1-3  کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..
17	1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….
17	1-4 بافت استخوان ……………………………………………..
20	1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ……………………………..
21	1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..
23	1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..
23	1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..
24	1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..
25	1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………
25	1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..
27	1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………
29	1-7 عنصر بور ……………………………………..
30	1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..
32	1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………
32	1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..
33	1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………
34	1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….
34	1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..
36	1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..
37	1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………
37	1-7-7 سرطان ……………………………………………………….
39	1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….
40	1-9 بور و خون ………………………………………………………..
41	1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………
42	1-11 سمیت بور …………………………………………….
44	1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………
45	مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………
47	هدف مطالعه ……………………………………………………………..
	فصل دوم: مواد و روش­ها
50	2-1  انتخاب رت ……………………………………………………………….
50	2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..
52	2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………
54	2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….
54	2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….
55	2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………
55	2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..
57	2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….
57	2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..
58	2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با بهره گرفتن از سنجش تترازولیوم …………………………………………………
59	2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….
60	2-5  انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..
60	2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….
61	2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………
63	2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..
62	2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با بهره گرفتن از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..
65	2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….
65	2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………
65	2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………
66	2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….
66	2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………
68	2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………
70	2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………
72	2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک
72	2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..
73	2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………
73	2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….
73	2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با بهره گرفتن از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………
74	2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..
75	2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه ­گیری میزان کلسیم …..
76	2-8-4-2 اندازه ­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..
81	2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..
	فصل سوم: نتایج
82	3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………
82	3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………
82	3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………
85	3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………
87	3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..
89	3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……
91	3-1-6  میزان الکترولیتها…………………………………………..
92	3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..
92	3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..
93	3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با بهره گرفتن از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک
96	3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..
97	3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..
100	3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم ……………………………………..
101	3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….
101	3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..
103	3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..
103	3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………
	فصل چهارم: بحث و نتیجه ­گیری
105	4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..
105	4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………
108	4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………
109	4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….
113	4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………
116	4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………
116	4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….
119	4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….
120	4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….
124	4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..
127	4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..
128	4-3  نتیجه گیری ………………………………………………………
129	4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….
	فصل پنجم:ضمیمه
131	5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….
131	5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS– …………………………….
132	5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+………………………
132	5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..
133	5-5  آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………
133	5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….
133	5-7  تهیه کریستال ویولت ………………………………………
133	5-8 روش تهیه محلول   MTT………………………………….
133	5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl…………………..
133	5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) …………
134	5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….
134	5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………
134	5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………
135	5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….
135	5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

تعریف سلول­های بنیادی

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و  پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com) خرید اینترنتی فایل متن کامل :

 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

   تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

   سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده ­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).

 

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا

   سلول­های بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیم ­بندی می­شوند

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی

  کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.

سلول­های بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)[9]جنین در مرحله بلاستوسیت به دست می­آیند. بلاستوسیت مرحله­ ای از تکوین پیش از لانه­گزینی در PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد می­ شود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کره­ای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانه­گزینی در رحم، بخشی از جفت را می­سازد. همچنین این کره مجتمعی از سلول­ها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایه ­های مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).

شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلول­های بنیادی جنینی که توانایی ایجاد سلول­های هر سه لایه­ی زاینده­ی جنینی را دارا می­باشد و همچنین سلول­های بنیادی بالغ که توانایی خودنوزایی و تمایز را دارند (5) .

1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف[10]

   خون بند ناف غنی از سلول­های بنیادی و سلول­های خونساز است. این سلول‌ها بسیار پرتوان و نامیرا هستند و همچنین در اثر تکثیرهای پی در پی دچار پیری نمی‌شوند، به طوری­که با تزریق‌ و یا جایگزینی آنها در بافت‌‌هایی که آسیب جدی دیده‌اند می‌توانیم به بهبودی و تشکیل سلول‌های جدید بافت کمک نمائیم. خون بند ناف دارای 6/0 تا 1 درصد سلول‌های پیش‌ساز خونی و بنیادی خون‌ساز است. ژله وارتون بند ناف منبع غنی از موکوپلی­ساکاریدها بوده که سلول­های بنیادی بالغ نیز در آن یافت می­ شود (6). خون بند ناف دارای مزایای زیادی چون محدود نبودن به اهداکننده، بلوغ کمتر سلول نسبت به سلول‌های فرد بالغ و کاهش احتمال پس­زدگی پس از پیوند می‌باشد (7). همچنین خون بند ناف را می‌توان ذخیره نمود و در موارد نیاز برای خود شخص یا فرد دیگری استفاده نمود. استفاده از این سلول‌ها در درمان بیماری‌ها چندان معمول نیست ولی این سلول‌ها در درمان دیابت نوع 1، بیماری‌های قلبی و عروقی، لوپوس اریتماتوس، بیماری‌های نورولوژیک مانند سکته مغزی، پارکینسون و آلزایمر، کم‌خونی‌ها و نقص ایمنی و بیماری‌های کبدی به کار می‌رود (شکل 1-4) (6).

 

شکل 1-4: نمایی از بند ناف (رگ‌های بند ناف (2 سرخرگ و یک سیاهرگ) و ژله وارتون[11] و غشا خارجی) (www.mdpi.com).

1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان (Adult stem cells):

انواع سلول بنیادی بالغ

بسیاری از بافت­های بالغ حاوی سلول­های بنیادی هستند و قدرت تمایز و توانایی خود نوزایی را دارند، به این سلول­ها سلول­های بنیادی بالغ گفته می‌شود. در زیر چند مثال از این نوع سلول‌ها آورده شده است:

الف) سلول بنیادی عصبی

   سلول بنیادی عصبی، سلول پرتوانی است که:

 1) قادر به تکثیر و تولید پیش‌سازهایی است که قابلیت تبدیل به سه نوع اصلی سلول‌های سیستم اعصاب مرکزی را دارند: یعنی آستروسیت‎‌ها، الیگودندروسیت‌ها و نورون‌ها.

2) این سلول‌ها توانایی خودنوزایی را داشته و همچنین به صورت متقارن و نامتقارن تقسیم می­گردند.

3) یک سلول بنیادی عصبی خصوصیت پرتوانی خود را تا زمانی طولانی حفظ می­ کند (8).