فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهش­دما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیب­های ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم می­ شود که می ­تواند زنده­مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیق­کننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پس­ازفرایند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفته­ای 2 بار جمع­آوری شد. نمونه­های منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخ­گشایی پایوت­های حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرک­کل­وتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازه ­گیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرم­های زنده و مورفولوژی اسپرم­ها بعد از فرایند یخ­گشایی اندازه ­گیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ در مقایسه با سایر سطوح­های آزمایشی موجب بهبود معنی­دار­ در میزان تحرک­ کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگی­غشا و اسپرم­های­زنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنی­داری روی مورفولوژی اسپرم­ها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ به رقیق‌کننده­ های انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­های اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرم­های زنده میشود. کلید واژه ها : لسیتین، رقیق کننده، اسپرم منجمد، قوچ افشاری پرورش گوسفند پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانی­می­باشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کننده­ های بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرایند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابی­عملکرد این رقیق کننده­ها با تست‌های­آزمایشگاهی مهم­مرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تست­ها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامه­ های اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد. 1-2- حفظ انجماد منی حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکی­ارائه می­ کنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرایند انجماد- ذوب وارد می­ شود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد می­گردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سال­های اخیر، ابداع و توسعه­ انواع رقیق کننده­ های منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گسترده­ای برای تولید رقیق کننده­ هایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، می­توان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با بهره گرفتن از اسپرم قوچ­های با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقال­آسان منی­از مراکز تولید و جمع­آوری به دورترین دامداری­ها، انجام زایش­خارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونه­ های در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000). در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیب­های وارد شده به اسپرم در طول فرایند انجماد- ذوب تمرکز نموده ­اند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالی­که، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیب­ها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرایند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابی­های آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگ­های فلورسنت با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیه­و تحلیل گسترده­تری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگی­غشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتین­وظرفیت­دارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001). در چند سال گذشته رقیق­کننده­ های جدید حاوی لسیتین­سویا برای جایگزینی زرده تخم­مرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گیل و همکاران، 2003: فوکویی و همکاران، 2007). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیب­های وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیب­های انجمادی به اسپرم را در طی فرایند انجماد-ذوب می­طلبد. بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقایسه آن­ها و انتخاب بهترین سطوح آن­ها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب می­باشد.در طول سال­های اخیر، پژوهش­های بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی[5] قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرك اسپرم پس از انجماد–ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل كیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب­های دمایی، کاهش استرس­های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرم­ها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم­ نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرم­ها در برابر آسیب­های انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است. فرایند انجماد اسپرم اکثر PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران مستلزم گذراندن دو مرحله می­باشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن[6] نامیده می­ شود، دمای منی رقیق شده از دمای 35-30 درجه به 5 درجه سلسیوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن می­باشد، دمای منی رقیق شده از 5 درجه به 196- درجه سلسیوس در نیتروژن مایع کاهش داده می­ شود. در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی، رقیق كننده­های سرمایی به منی اضافه می­گردد. این رقیق كننده­ها معمولا حاوی لسیتین، پروتئین­ها و لیپوپروتئین­های زرده تخم­مرغ می­باشند. در ابتدای مرحله دوم كه مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ، از رقیق كننده­های انجمادی كه حاوی 7-3 درصد گلیسرول است استفاده می­ شود که موجب حفظ اسمولاریته شده و ظرفیت بافری رقیق کننده را تامین می­ کند (دیپاز و همکاران، 2010: ویندسور و وایت، 1995). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد دارای حساسیت بالایی می­باشند به طوری كه در طی فرایند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشا ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی می­ شود که در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول ­شود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود (هولت، 1984). بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرماتوزواهای با كیفیت بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول در حین انجماد اسپرم در سال 1949 میلادی توسط پولژ باعث شد که بتواند برای اولین بار اسپرم حیوانات را منجمد کند. اینکه چگونه گلیسرول باعث حفظ اسپرم در حین انجماد می­ شود یک پدیده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانیسم ع خرید اینترنتی فایل متن کامل : مل آن اختلاف نظر وجود دارد. گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان می­دهد. برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستال­های یخ درون سلولی می­ شود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی می­ شود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط می­ شود که درنتیجه غلظت الکترولیت­های آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستال­های یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد که در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظت­های نمک محافظت می­ شود(مکلاگین و همکاران، 1992). علاوه بر گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن­گلایکول هم استفاده می­شوند که دارای وزن مولكولی كم هستند و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده[7] نامیده می­شوند.